Refinamiento de un ovino - Mascarilla Co., Ltd

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13912 (2023) Citar este artículo

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Se requiere el desarrollo de nuevas terapias contra el SARS-CoV-2 para ampliar el conjunto de herramientas de estrategias de intervención para combatir la pandemia global. En este estudio, se utilizó plasma hiperinmune de ovejas inmunizadas con proteína recombinante de pico completo SARS-CoV-2 para generar productos candidatos. Además de la IgG purificada, hemos refinado las terapias candidatas eliminando la IgG no específica mediante unión por afinidad junto con fragmentación para eliminar la región Fc y crear fragmentos F(ab′)2. Se evaluó la actividad in vitro de estas preparaciones y se demostró que son fuertemente neutralizantes contra una variedad de cepas de SARS-CoV-2, incluida Omicron B2.2. Además, se evaluó su protección contra las manifestaciones de enfermedades y las cargas virales utilizando un modelo de infección de hámster por SARS-CoV-2. Los resultados demostraron efectos protectores tanto de IgG como de F(ab′)2, y este último requirió dosificación secuencial para mantener la actividad in vivo debido a su rápida eliminación de la circulación.

El brote del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2 (SARS-CoV-2), que resultó en una pandemia mundial en curso declarada por primera vez en marzo de 20201, ha creado una urgencia para desarrollar y evaluar nuevas intervenciones. Como parte de esta actividad, hemos desarrollado inmunoglobulinas ovinas purificadas contra toda la proteína de pico del SARS-CoV-2, junto con inmunoglobulinas específicas para las subunidades S1 y S2 individuales, que brindan protección contra la aparición de la enfermedad2.

Si bien sus efectos terapéuticos son muy eficaces, uno de los principales problemas de las terapias con antisueros y con IgG completa son los riesgos de enfermedad del suero3,4 y reacciones alérgicas5. Además, también se ha demostrado que los anticuerpos específicos del SARS-CoV muestran un efecto de mejora, especialmente cuando se administran en niveles bajos6. Esta mejora dependiente de anticuerpos también se ha confirmado en el SARS-CoV-27,8. Además de estas secuelas potencialmente adversas, en la infección por SARS-CoV-2 la lesión pulmonar aguda se ha asociado con la región Fc de la IgG9 anti-pico específica. Para superar estos efectos, se ha llevado a cabo la eliminación de la región Fc para usos de inmunoterapia pasiva de próxima generación10,11,12.

La eliminación de Fc puede producir fragmentos monovalentes (Fab) o divalentes (F(ab′)2). Los fragmentos Fab más pequeños se eliminan rápidamente a través de las funciones renales13 y en estudios clínicos se ha demostrado que se eliminan entre 5 y 7 veces más rápido que el F(ab′)214. Además de los beneficios de reducir los efectos secundarios, el tamaño más pequeño y la afinidad celular reducida de los fragmentos F(ab′)2 les permite penetrar más profundamente en los tejidos, permitiendo así la actividad dentro de las regiones extravasculares15,16 y la distribución entre los compartimentos del cuerpo, incluidos los pulmones17. . En conjunto, estas propiedades adicionales pueden conferir ventajas sobre el uso de plasma convaleciente autorizado por primera vez para uso de emergencia por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (FDA) en las primeras etapas de la pandemia.

Las inmunoglobulinas de origen animal se han utilizado ampliamente como antivenenos18 y se han extendido a las antitoxinas19. El uso de sueros hiperinmunes para generar terapias basadas en anticuerpos contra enfermedades infecciosas se ha utilizado para el SARS-CoV20, el MERS-CoV21, el Ébola22,23,24 y el virus de la influenza aviar25. Durante la pandemia de COVID-19, esta metodología ha sido empleada por múltiples grupos, aunque principalmente utilizaron caballos como fuente original de anticuerpos17,26. En este trabajo, describimos el uso de un enfoque basado en ovinos. Las ovejas ofrecen una alternativa adecuada, ya que los caballos se consideran animales de compañía y no se les permite producir anticuerpos en países como el Reino Unido18. Procesamos plasma hiperinmune de ovejas inmunizadas con proteína recombinante de pico completo del SARS-CoV-2 en tres preparaciones: IgG purificada, IgG purificada por afinidad y fragmentos F(ab′)2 (Fig. 1) que luego evaluamos para determinar su actividad in vitro. antes de evaluarlo en un modelo desarrollado de infección de hámster de la infección por SARS-CoV-227.

El diagrama esquemático describe el proceso para producir IgG purificada, IgG purificada por afinidad y preparaciones de fragmentos F(ab'2) desarrolladas como candidatos terapéuticos para el SARS-CoV-2.

Para evaluar la unión de las preparaciones después de diferentes etapas de refinamiento, se realizaron estudios ELISA utilizando proteínas de pico recombinantes. Los resultados demostraron el reconocimiento de los anticuerpos y los fragmentos F (ab′) 2 de la proteína de pico completa y el reconocimiento de las subunidades S1 y S2 (Fig. 2). Los ELISA anteriores sobre preinmunización con suero ovino no demostraron reactividad cruzada con la proteína de pico recombinante2. Como se esperaba, hubo una mayor unión de la preparación purificada por afinidad en comparación con la preparación purificada debido a la eliminación de IgG no específica. Para la preparación del fragmento F(ab′)2, los niveles de unión fueron equivalentes a los de la IgG purificada.

Cinética de unión al antígeno de fragmentos purificados, purificados por afinidad y F (ab′) 2 a glicoproteínas recombinantes del SARS-CoV-2. (a) Reactividad a la proteína de pico completa. (b) Reactividad a la proteína de la subunidad S1. (c) Reactividad a la proteína de la subunidad S2. Las líneas indican valores medios con barras de error que indican el error estándar.

En un ensayo de neutralización de virus vivos, todas las preparaciones demostraron actividades contra las cepas alfa (Victoria) y ómicron (BA.2) del SARS-CoV-2 (Tabla 1). La actividad de neutralización aumentó con el refinamiento de las preparaciones, demostrando los fragmentos F(ab′)2 la actividad más fuerte. Para determinar si las preparaciones reconocerían las proteínas de pico de otras variantes del SARS-CoV-2, se realizaron pruebas adicionales utilizando el dominio de unión al receptor (RBD) y la proteína de pico completa de alfa (B.1.1.7) y beta (B.1.351). y cepas gamma (P.1). Los resultados mostraron una fuerte unión de ACE2 en todas las cepas analizadas (Tabla 2). Además de las pruebas de neutralización, se evaluaron otras actividades funcionales. Los ensayos de deposición de complemento dependiente de anticuerpos y los ensayos de fagocitosis de neutrófilos demostraron actividad en las preparaciones de anticuerpos, pero cuando se eliminó el fragmento Fc, la actividad del complemento se redujo y no hubo evidencia de ningún efecto opsonofagocítico (Tabla 3).

Para determinar la actividad de las preparaciones a base de anticuerpos para proteger contra la infección por SARS-CoV-2, se realizó la administración a hámsteres antes de la exposición al SARS-CoV-2 (Fig. 3a). Dos animales en el grupo F (ab′) 2 y uno en el grupo PBS cumplieron criterios de valoración clínicos humanos (Fig. 3b), pero no alcanzaron significación estadística (P > 0,05, supervivencia de rango logarítmico). En el grupo de control de PBS, se observó pérdida de peso, mientras que aquellos que recibieron preparaciones a base de anticuerpos tuvieron una pérdida significativamente menor o ninguna reducción en los días 3 a 5 después de la exposición (P <0,05, prueba de Mann-Whitney) (Fig. 3c). En el grupo de IgG purificada, esta importancia se extendió hasta el final del estudio, el día 7 después del desafío. Las puntuaciones clínicas se evaluaron dos veces al día, y los animales que recibieron compuestos mostraron puntuaciones significativamente más bajas en los días 3 a 4 después de la exposición y durante el día 5 para los grupos de anticuerpos purificados y purificados por afinidad (P <0,05, prueba de Mann-Whitney) (Fig. 3d ).

Prueba de respuestas protectoras de anticuerpos y preparaciones de F(ab′)2 contra el SARS-CoV-2 en hámsteres. (a) Esquema del programa de estudio, con n = 6 hámsteres por grupo. (b) Gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier. (c) Cambios en el peso corporal de los animales como porcentaje en comparación con el peso del día del desafío. (d) Puntuación clínica de los animales. (c,d) Las líneas muestran valores medios con barras de error que indican el error estándar. *Indica una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el grupo de control de PBS (P <0,05, prueba de Mann-Whitney).

Para determinar los niveles del compuesto en el sistema circulatorio, se evaluaron muestras de suero recolectadas el día del desafío. Los resultados mostraron niveles altos en los grupos que recibieron preparaciones de anticuerpos purificados y purificados por afinidad, pero niveles más bajos en el grupo F (ab ′) 2 (Fig. 4a). Un animal en el grupo que recibió anticuerpo purificado por afinidad no tenía anticuerpos circulantes demostrables; A continuación se comparó a este hámster con otros animales individuales de este grupo. Los resultados revelaron una mayor pérdida de peso en este animal (Fig. 4b), pero la puntuación clínica siguió siendo similar a la de otros animales del grupo (Fig. 4c).

Niveles de anticuerpos circulantes el día de la exposición y comparación de los resultados clínicos con un animal en el que no se detectaron anticuerpos en circulación. (a) Unión del anticuerpo a la proteína de espiga completa. Los resultados muestran el nivel medio de absorbancia de cada animal analizado en una dilución 1:100. Los gráficos de barras y bigotes denotan la media y el error estándar. *Indica significación estadística (P < 0,05, prueba de Mann-Whitney). (b) Cambio de peso corporal y (c) Puntuación clínica de animales individuales que reciben anticuerpos purificados por afinidad, con el animal individual con niveles indetectables representado por símbolos abiertos.

Se recogieron muestras de hisopos faríngeos cada dos días después de la exposición y se analizaron mediante PCR para observar los niveles de ARN viral. No se observaron diferencias significativas en los niveles de ARN entre aquellos que recibieron compuestos basados en anticuerpos en comparación con el grupo de control de PBS (Fig. 5a). El día 2 después de la exposición, se analizó una muestra de lavado nasal y una muestra de hisopo faríngeo para detectar la presencia de virus vivo. En el lavado nasal, hubo una reducción significativa en el grupo que recibió IgG purificada por afinidad (P <0,05, prueba de Mann-Whitney) (Fig. 5b), pero no se observaron diferencias significativas en los hisopos faríngeos (Fig. 5c). En la necropsia, se evaluaron los niveles de ARN viral en el pulmón, observándose una reducción significativa en los niveles de ARN viral en los animales que recibieron IgG purificada (P <0,05, Mann-Whitney) (Fig. 5d).

Niveles de carga viral en muestras de animales que recibieron compuestos a base de anticuerpos antes de la exposición al SARS-CoV-2. (a) ARN viral en hisopos faríngeos. Las barras muestran valores medios y las barras de error indican el error estándar. (b) Respuestas de títulos virales de muestras de lavado nasal y (c) hisopo faríngeo recolectado 2 días después de la exposición. Los gráficos de barras y bigotes denotan la media y el error estándar. (d) Niveles de ARN viral en muestras de pulmón recolectadas en el momento de la necropsia. Las barras muestran valores medios y las barras de error indican el error estándar. * indica significación estadística (P <0,05, prueba de Mann-Whitney).

Se observaron lesiones compatibles con la infección por SARS-CoV-2 con diversa gravedad en el pulmón y la cavidad nasal de los animales tanto del grupo de prueba como del de control. En el pulmón, las lesiones típicamente comprendían una neumonía broncointersticial con áreas de consolidación. Gran cantidad de células inflamatorias, principalmente macrófagos y neutrófilos con algunos linfocitos y células plasmáticas, infiltran espacios alveolares, con daño y pérdida celular; En algunas zonas se observó hiperplasia alveolar tipo II prominente, junto con edema alveolar. Las vías respiratorias también estaban infiltradas por células inflamatorias similares. Mientras que las vías respiratorias más grandes contenían menos células inflamatorias, los cambios en las vías respiratorias más pequeñas fueron de mayor gravedad, con degeneración y pérdida epitelial concomitante. Las vías respiratorias estaban rodeadas de forma variable por linfocitos y otras células inflamatorias. También se observaron linfocitos rodeando los vasos sanguíneos y ocasionalmente infiltrándose en las paredes. La gravedad de los cambios microscópicos varió entre los grupos (Fig. 6a) con una reducción estadísticamente significativa en las puntuaciones totales observada para el grupo que recibió anticuerpo purificado en comparación con el grupo de control de PBS (P <0,05, prueba de Mann-Whitney) (Fig. 6b). . Además, se detectó ARN viral en un animal de cada uno de los grupos PBS y F(ab′)2; El tejido pulmonar de los animales restantes en los cuatro grupos fue negativo.

Cambios histopatológicos en el pulmón y la cavidad nasal de animales que recibieron compuestos a base de anticuerpos antes de la exposición al SARS-CoV-2. (a) Mapa de calor que muestra las puntuaciones de gravedad de los cambios histopatológicos individuales y las puntuaciones promedio en el pulmón y la cavidad nasal (puntuación subjetiva). Infiltración de las vías respiratorias por células inflamatorias, PV peri-vascular de células inflamatorias, PA peri-vía aérea de células inflamatorias, infiltración alveolar de los espacios alveolares y de la pared por células inflamatorias, NC exudado exudado de células inflamatorias en la luz de la cavidad nasal, NC necrosis epitelial degeneración celular y necrosis en la cavidad nasal, (b) puntuaciones histopatológicas totales de cambios en el pulmón y (c) cavidad nasal (puntuación subjetiva). (d) El grado de tinción del ARN viral en la cavidad nasal (análisis cuantitativo). (b – d) Los gráficos de barras y bigotes indican la media y el error estándar. *Indica significación estadística (P < 0,05, prueba de Mann-Whitney).

En la cavidad nasal, las lesiones se caracterizaron por degeneración variable y necrosis del epitelio de la mucosa respiratoria y olfatoria; y la presencia de exudados luminales, que comprenden líquido mucoso y proteico y mezclado con células inflamatorias, principalmente neutrófilos degenerados con algunas células mononucleares. Hubo una reducción estadísticamente significativa en las puntuaciones totales para los grupos que recibieron el anticuerpo purificado o la preparación purificada por afinidad en comparación con el grupo de PBS (P <0,05, prueba de Mann-Whitney) (Fig. 6c). Se observó tinción de ARN viral en la cavidad nasal, con niveles significativamente más bajos en los animales que recibieron IgG purificada en comparación con el grupo de control de PBS (P <0,05, prueba de Mann-Whitney). No se observaron diferencias significativas entre el grupo de control de PBS y los que recibieron las preparaciones purificadas por afinidad o F (ab′) 2 (Fig. 6d).

En la Fig. 7 se muestran imágenes representativas de la gravedad de los cambios microscópicos en el pulmón y la cavidad nasal.

Imágenes representativas de cambios microscópicos en el pulmón y la cavidad nasal. Fila superior, pulmón: áreas multifocales a parcheadas de consolidación neumónica (asteriscos) (H&E); fila central, cavidad nasal: inflamación y degeneración de la mucosa de parches a difusos con exudado luminal variable (flechas) (H&E); fila inferior, tinción de la cavidad nasal para ARN viral del SARS-CoV-2 en la mucosa y exudado luminal (ISH).

Debido a la detección de niveles más bajos de F(ab′)2 en la circulación en el momento de la exposición en comparación con las preparaciones de inmunoglobulinas completas, se realizó un estudio adicional utilizando un régimen de dosificación repetida. Los hámsteres recibieron una dosis de F (ab′) 2 el día anterior al desafío y luego diariamente durante todo el estudio (Fig. 8a). En esta configuración experimental, los resultados clínicos después de la exposición al SARS-CoV-2 mejoraron significativamente en aquellos que recibieron F(ab′)2. Después de una pequeña pérdida (<5%) de peso corporal, este se recuperó en el día 7 en aquellos que recibieron F (ab′) 2 en comparación con el grupo de control de PBS (Fig. 8b). Además, aparte de los signos de pelaje erizado en un solo animal en el grupo F (ab′) 2 en 2 momentos, no se informaron otros signos clínicos en contraste con las puntuaciones clínicas sostenidas en aquellos que recibieron el control de PBS (Fig. 8c). Se midieron los niveles de ARN viral en hisopos faríngeos, con respuestas similares entre los dos grupos (Fig. 8d). El día 7 después de la exposición, se realizó la necropsia a los animales y se recogieron muestras para análisis de carga viral y examen histológico. Los niveles de ARN viral en el pulmón fueron significativamente más bajos en los animales que recibieron F (ab ′) 2 en las áreas caudal y media (Fig. 8e). El análisis histológico demostró una consolidación pulmonar y puntuaciones histopatológicas significativamente más bajas en la cavidad nasal en el grupo F (ab ′) 2 en comparación con aquellos que recibieron el control de PBS (Figs. 8f, g).

Resultados clínicos, virológicos e histopatológicos de animales que recibieron preparaciones intraperitoneales diarias de F (ab′) 2. (a) Descripción esquemática del diseño del estudio. (b) Cambio en el peso corporal y (c) puntuación clínica. Las líneas muestran valores medios con barras de error que indican el error estándar. (d) Niveles de ARN viral de hisopos faríngeos. Los diagramas de caja y bigotes muestran el valor medio y el error estándar. (e) Niveles de ARN viral de muestras de pulmón. (f) Porcentaje de área de pulmón con consolidación según lo determinado por análisis de imágenes. (g) Puntuaciones de histopatología de la cavidad nasal. *Indica significación estadística (P < 0,05, prueba de Mann-Whitney).

Los resultados presentados dan cuenta de las actividades de la IgG completa de la proteína de pico anti-SARS-CoV-2 ovina en comparación con una preparación refinada de F(ab′)2. Los resultados de la prueba de neutralización en vivo mostraron que nuestro F(ab′)2 ovino tenía una media geométrica de concentración inhibidora del 50% (CI50) de 0,06 μg/ml. Esto es comparable con candidatos equinos F(ab′)2 similares que demostraron una CI50 de 0,07 μg/ml11. Además, nuestra preparación ovina F(ab′)2 demostró actividad de inhibición de la unión de ACE2 contra una variedad de cepas de SARS-CoV-2, incluidas Alpha, Beta, Gamma y Omicron. Si bien los fragmentos F(ab′)2 equinos también han mostrado actividad neutralizante en múltiples cepas, éstas solo llegaron hasta las variantes Delta26. Nuestro trabajo con la cepa Omicron BA2, la última variante en el momento de escribir este artículo, amplía el conocimiento de la eficacia neutralizante de nuestro candidato de origen ovino. Esta reactividad cruzada muestra el potencial prometedor de este enfoque terapéutico.

Si bien la neutralización del virus es probablemente un mecanismo de acción importante, al ser multivalente, tanto la IgG como el F(ab′)2 también pueden formar complejos anticuerpo-objetivo que pueden eliminarse mediante fagocitosis28. Sin embargo, demostramos que no hubo evidencia de actividad fagocítica de la preparación ovina F(ab′)2 en contraste con la de la IgG completa. Tanto IgG como F(ab′)2 exhibieron depósito de complemento, de acuerdo con otros informes29. Si bien esto puede permitir un mecanismo antiviral alternativo, existe un riesgo potencial de que también pueda inducir reacciones anafilácticas a través de la activación del complemento4, por lo que se requieren más estudios.

Para determinar su efecto contra la enfermedad, las preparaciones de IgG y F(ab′)2 se probaron en un modelo de desafío de infección por SARS-CoV-2. En un estudio inicial en el que los animales recibieron anticuerpos intraperitoneales el día antes del desafío, las preparaciones de IgG completas dieron como resultado un mejor resultado clínico en comparación con aquellos que recibieron fragmentos F(ab′)2. Se han informado diferencias en el grado de protección con estrategias similares que utilizan este enfoque para las antitoxinas contra la ricina, donde la IgG completa funciona mejor después de una sola administración; Es probable que esto se deba a que F(ab′)2 no mantiene concentraciones suficientemente altas en la sangre para brindar protección30. El hallazgo de que los niveles de F(ab′)2 circulante eran significativamente más bajos que los de IgG total se debe a que su masa molecular variable da diferentes perfiles farmacocinéticos13,31,32. El F(ab′)2 producido a partir de fuentes equinas ha mostrado una vida media plasmática de aproximadamente 47 h26. Se llevó a cabo un segundo estudio en el que se administró F(ab′)2 diariamente para contrarrestar las concentraciones más bajas en el sistema circulatorio después de la administración. Como las condiciones eran idénticas a las del estudio anterior y para reducir el número de animales utilizados según los criterios NC3R, las preparaciones de IgG no se repitieron para este experimento. Los resultados de este estudio mostraron beneficios significativos contra la progresión de la enfermedad clínica y los niveles de virus, especialmente en el pulmón, donde tanto los niveles de ARN viral como la consolidación pulmonar fueron significativamente más bajos que en los animales tratados de forma simulada. Estos resultados demuestran que F(ab′)2 puede ofrecer efectos positivos contra la infección por SARS-CoV-2, aunque será necesario seguir trabajando para determinar un efecto terapéutico ya que la dosificación comenzó antes de la exposición al virus en este estudio.

Para todas las preparaciones de IgG, nuestros resultados demostraron que la IgG purificada dio como resultado una gravedad reducida de los cambios patológicos y una reducción del ARN viral pulmonar en comparación con la IgG purificada por afinidad. Este hallazgo fue inesperado e indica que los anticuerpos no específicos pueden desempeñar un papel en la manifestación de la enfermedad. Como las ovejas se mantienen afuera, probablemente habrán estado expuestas a una amplia gama de estímulos que resultarán en la producción de IgG. Antes de iniciar el estudio, las ovejas fueron examinadas en busca de evidencia de exposición a pestivirus (como el virus de la frontera), lengua azul, Brucella ovis y fiebre Q; pero puede haber estado expuesto a otros patógenos autóctonos. Las ovejas también fueron vacunadas contra la enfermedad de Johnes con una vacuna multivalente (Glanvac 6 en 1 o equivalente), para controlar cinco enfermedades clostridiales y la linfadenitis caseosa, que puede haber proporcionado propiedades inmunoestimulantes adicionales. Se ha sugerido protección contra el SARS-CoV-2 con enfoques de vacunación no específicos, como la vacuna BCG contra la tuberculosis33. Este enfoque se probó en un modelo de primates no humanos y demostró que la vacunación con BCG inducía mecanismos inmunitarios heterólogos que podrían contribuir a moderar la gravedad de la enfermedad por SARS-CoV-2, aunque no hubo evidencia de una mayor eliminación viral o de una reducción de la patología de la enfermedad34.

Si bien los anticuerpos monoclonales son sin duda una terapia concisa y pueden fabricarse sintéticamente, son inherentemente susceptibles a escapar de las mutaciones. Esto se ha encontrado con el bamlanivimab clínicamente aprobado, que perdió reactividad contra la variante Delta35,36. Los beneficios de los anticuerpos policlonales que reconocen una amplia gama de epítopos en la proteína de pico los hacen mucho menos propensos a evadir los cambios evolutivos. El desarrollo clínico de terapias basadas en anticuerpos policlonales derivados del plasma hiperinmune es factible y alcanzable, como lo demuestra su uso como antivenenos18. Además, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha publicado directrices para la producción, control y regulación de inmunoglobulinas de origen animal para su uso como antivenenos37 y existe una monografía de la Farmacopea Europea sobre inmunosueros para uso humano, animales (0084); por lo tanto, existe una estrategia de aprobación que es transferible a otras aplicaciones, como las terapias para enfermedades infecciosas.

Si bien se probaron solos durante esta fase de desarrollo, es probable que en entornos clínicos se administren terapias basadas en anticuerpos junto con otros tratamientos. Para la influenza aviar H5N1, un producto F(ab′)2 demostró efectos sinérgicos cuando se administró junto con la terapia antigripal ampliamente utilizada, oseltamivir38. De manera similar, un fragmento F(ab′)2 contra la rabia también crea sinergia con la profilaxis post-exposición existente, es bien tolerado y aumenta la eficacia39.

En resumen, nuestro trabajo demuestra el refinamiento de IgG completa ovina en una preparación F(ab′)2; y la eliminación de la región Fc probablemente reduzca varias reacciones adversas asociadas con los anticuerpos completos. Ahora se requiere más trabajo preclínico para optimizar las estrategias de dosificación y evaluar el uso terapéutico antes de considerarlo para el desarrollo clínico.

La glicoproteína de pico de SARS-CoV-2 de longitud completa se produjo en células de ovario de hámster chino (CHO) con una etiqueta His incorporada (REC31868; Native Antigen Company, Reino Unido). De manera similar, las proteínas de las subunidades S1 y S2 del SARS-CoV-2 también se produjeron en células CHO (REC31869 y REC31870, respectivamente; Native Antigen Company, Reino Unido).

Las ovejas Border Leicester Cross Merino, de 12 meses o más y nacidas en Australia, se obtuvieron de un proveedor aprobado y se mantuvieron en una granja controlada registrada en el Departamento de Agricultura de Australia. La granja opera bajo un estado sanitario y estándares de bienestar animal extremadamente altos, y los animales reciben inspecciones sanitarias y controles veterinarios semanalmente y dentro de los 3 días posteriores a la toma de muestras de sangre.

Se obtuvieron hámsteres sirios dorados, de entre 7 y 9 semanas de edad (rango de peso de 107 a 177 g), de una instalación acreditada por el Ministerio del Interior del Reino Unido (Envigo RMS UK Ltd). Los animales se alojaron en jaulas de acuerdo con los requisitos del Código de prácticas del Ministerio del Interior del Reino Unido para el alojamiento y cuidado de animales utilizados en procedimientos científicos (1986). Durante los procedimientos con SARS-CoV-2, los animales se alojaron en un aislador de película flexible dentro de una instalación de Nivel de Contención 3. Los animales fueron asignados aleatoriamente en grupos, con asignación igual de animales machos y hembras. Se utilizaron tamaños de grupo de 6 hámsteres como el número mínimo requerido para lograr significación estadística. Los animales fueron sedados antes de realizar lavados nasales. El acceso a alimentos y agua era ad libitum y se proporcionaba enriquecimiento ambiental. Todo el trabajo experimental se realizó bajo la autoridad de una licencia de proyecto aprobada por el Ministerio del Interior del Reino Unido que había sido sujeta a una revisión ética local en Public Health England (ahora parte de la Agencia de Seguridad Sanitaria del Reino Unido [UKHSA]) Porton Down por Animal Welfare and Ethical Review. Body (AWERB) según lo exige la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Ministerio del Interior de 1986. Los criterios de valoración clínicos humanitarios se determinaron mediante una pérdida de peso corporal del 20 % o signos graves de enfermedad/angustia, y los animales que alcanzaron estos límites fueron sacrificados.

La producción de plasma e IgG fue realizada por International Therapeutic Proteins Ltd. Se inmunizaron seis ovejas en un programa de 28 días con 0,5 mg de proteína de pico recombinante de longitud completa administrada mediante inyección subcutánea en seis sitios: axilas (× 2), regiones inguinales (× 2 ) y supraescápula (× 2). Se utilizó adyuvante completo de Freund para la primera inmunización y posteriormente adyuvante incompleto de Freund. Después de un período de preparación que incluyó dos inmunizaciones, se recogió plasma mediante plasmaféresis utilizando una máquina MCS automatizada (Haemonetics Corporation, EE. UU.). Cada recolección generalmente produjo 600 ml de plasma que se almacenó a -25 °C hasta su posterior procesamiento. Se recogió plasma según un programa de 28 días, 2 semanas después de la inmunización. La fracción de IgG se purificó del plasma hiperinmune mediante una serie de fraccionamientos de polietilenglicol (PEG) y una precipitación con zinc. El producto se formuló a una concentración de 50 a 60 g/l en acetato de sodio 20 mM/tampón NaCl 20 mM.

La purificación por afinidad de los anticuerpos fue realizada por Native Antigen Company. Las columnas se fabricaron utilizando una mezcla 1:1 de proteína S1:S2 recombinante en una proporción de ~ 5 mg de proteína recombinante por ~ 1 g de Sefarosa deshidratada activada con bromuro de cianógeno (Cytiva) según las instrucciones del fabricante, lo que dio como resultado 5 ml. resina final por antígeno. El antígeno no unido se lavó con 3 × 2 volúmenes de columna (CV) de NaOAc 0,1 M, pH 4,0, NaCl 500 mM, seguido de 3 × 2 CV de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, NaCl 500 mM. Este ciclo de lavado se repitió dos veces. Para la purificación de anticuerpos, las resinas se transfirieron a columnas de flujo por gravedad de polipropileno de 10 ml (ThermoFisher).

Se ajustó el pH de la fracción de IgG precipitada con PEG mediante la adición de HEPES 1 M, pH 8,0 (1,25 ml por 10 ml de fracción de IgG original). Después de la centrifugación (10 min, 4000 x g, 20 °C), el sobrenadante clarificado se cargó en la columna de antígeno respectiva equilibrada en HEPES 10 mM pH 8,0 con un tiempo de contacto de aprox. 1,5 h. Las columnas se lavaron con 10 VC de tampón de equilibrado, seguido de 10 VC de HEPES 10 mM, pH 8,0, KCl 300 mM. Los anticuerpos se eluyeron con glicina 100 mM, pH 2,5. Las fracciones que contenían proteínas se combinaron y se ajustaron a pH 7-8 con Tris-HCl 1 M, pH 9,0 (1/5 del volumen original) antes de la diálisis en DPBS.

La fragmentación de anticuerpos fue llevada a cabo por MicroPharm Ltd. La preparación de IgG purificada por afinidad en masa se tituló a pH 3,1 usando ácido clorhídrico 0,5 M y se calentó. Una vez que la temperatura alcanzó los 28 °C, se añadió pepsina al 1% p/p y la mezcla se mezcló continuamente durante 30 min. La digestión se terminó añadiendo hidróxido de sodio 0,5 M, hasta que la solución alcanzó un pH de 5,7. El producto digerido terminado se clarificó antes de la concentración y diafiltración para eliminar los fragmentos del producto digerido de bajo peso molecular. Luego, el F(ab′)2 se enriqueció adicionalmente usando cromatografía de intercambio aniónico, antes de la formulación a 2,7 g/l en una solución salina tamponada con glicina, que contenía maltosa y PS80.

Se recubrieron placas de microtitulación Nunc MaxiSorp con 2 μg/ml de proteína recombinante en tampón bicarbonato durante la noche a 2–8 °C. Las placas se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tween20 al 0,05% (PBST) y se bloquearon durante 1 hora a 37 °C con tampón de bloqueo (leche desnatada en polvo al 5% en PBS). Las placas se incubaron durante 1 h a 37 °C con muestras prediluidas (sueros recolectados de muestras de sangre de oveja o preparaciones de anticuerpos purificados); lavado con PBST; y se incubaron con un conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-IgG ovina de burro (Producto 713-035-003; Jackson ImmunoResearch, EE. UU.) durante 1 h a 37 °C. Después de más lavados, se añadió sustrato TMB y la reacción se detuvo mediante la adición de solución de parada antes de leer la densidad óptica a una longitud de onda de 450 nm.

SARS-CoV-2 Australia/VIC01/2020 (adhesión a GISAID, EPI_ISL_406844) (aislado de Victoria)40 fue proporcionado generosamente por el Instituto Doherty, Melbourne, Australia y posteriormente se pasó en células Vero/hSLAM [ECACC 04091501] (Colección europea de células Cultures, Reino Unido) para producir un material de trabajo en el pasaje 4 (P4), en UKHSA, Porton Down, Reino Unido. El linaje BA.2 (Omicron) del SARS-CoV-2 se aisló en UKHSA, Porton Down, a partir de un hisopo nasofaríngeo tomado de un paciente del Reino Unido. Se realizó la secuenciación del genoma completo en el stock (pase 3) utilizado en este ensayo.

Se utilizó un ensayo de microneutralización utilizando células Vero-E6 (ECACC 85.020.206) y protocolos de inmunotinción, como se describió anteriormente41, para evaluar la actividad neutralizante de los anticuerpos ovinos, con las siguientes modificaciones. Los anticuerpos se diluyeron dos veces en un rango de dilución de 12 pasos (50 µg/ml–0,02 µg/ml), por duplicado (réplicas técnicas). El tiempo total de incubación para el aislado Victoria fue de 24 h mientras que para Omicron BA.2 fue de 26 h. La inmunotinción para ambos virus SARS-CoV-2 se realizó con anticuerpos antinucleocápside.

Los focos virales infecciosos se contaron con un analizador ImmunoSpot® S6 Ultra-V 367 con módulo de conteo BioSpot (Cellular Technologies Europe, Alemania). Luego, los datos de los focos contados se importaron a R-Bioconductor. Se realizaron tres experimentos independientes para cada anticuerpo. El control positivo interno para el aislado de Victoria fue plasma convaleciente, donado a UKHSA por el Servicio de Transfusión de Sangre de Irlanda del Norte (NIBTS), de un paciente que se recuperaba de un virus similar al de Wuhan. El control positivo interno para la variante Omicron BA.2 fue plasma convaleciente, donado a UKHSA, de un paciente que se recuperaba de una infección por Omicron.

Se utilizó un análisis probit de punto medio compilado con el programa R Statistical (versión 3.6.1) para determinar la cantidad (μg/mL) de anticuerpo necesaria para reducir los focos virales del SARS-CoV-2 en un 50 % (IC50) en comparación con el virus únicamente. control (n = 10).

Se analizó la capacidad de las muestras para inhibir la unión de ACE2 a diferentes variantes preocupantes (COV) mediante los ensayos MesoScale Discovery ACE2. Se evaluó una serie de diluciones dobles de los anticuerpos en la placa MSD 7 (K15440U), que alberga antígenos de pico de longitud completa y RBD específicos de Wuhan y diferentes COV: Alfa (B.1.1.7), Beta (B.1.351) y Gamma. (P.1). Las muestras se incubaron según las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresan en anticuerpos inhibidores (ng/ml).

Se acoplaron perlas fluorescentes azules magnéticas de carboxilo SPHERO (Spherotech, EE. UU.) con la proteína de pico completa del SARS-CoV-2 (Lake Pharma, 46,328) mediante un proceso sulfo-NHS/EDC de dos pasos42. La proteína Spike se introdujo en niveles de saturación y el acoplamiento se confirmó mediante la unión de IgG de un donante convaleciente de COVID-19 que se sabe que tiene altos niveles de IgG contra la proteína Spike. Calibrador de diagnóstico de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 NIBSC inactivado por calor (NIBSC, 20/162) en una dilución inicial de 1:40 (10 µl de suero en 30 µl de tampón de bloqueo (BB); PBS, albúmina sérica bovina al 2 % (BSA )) seguido de una dilución 1:10 en BB) con una unidad arbitraria asignada de 1000 U/ml se añadió por duplicado y se diluyó en serie 2:3 en BB. Se añadieron anticuerpos policlonales ovinos purificados por afinidad (3 µl por duplicado) a 27 µl de BB y se diluyeron en serie 1:3 en BB. A esto le siguieron 20 µl de perlas magnéticas recubiertas de proteína de pico de SARS-CoV-2 (50 perlas por µl) para dar un rango final de dilución en serie de 1:3 a partir de 1:20. La dilución en serie para el estándar NIBSC 20/162 comenzó en 1:80. La mezcla se incubó a 25 °C durante 30 min con agitación a 900 rpm. Las perlas se lavaron dos veces en 200 µl de tampón de lavado (BB + Tween-20 al 0,05 %) y luego se resuspendieron en 50 µl de BB que contenía IgG e IgM al 10 %. plasma humano empobrecido43 y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos con agitación a 900 rpm. A continuación, las perlas se lavaron dos veces con 200 µl de tampón de lavado y se resuspendieron en 100 µl de anticuerpo policlonal antihumano C3c de conejo conjugado con fluoresceína (FITC) (Abcam) diluido 1 :500 en BB y se incuba en la oscuridad. Después de dos lavados más con 200 µl de tampón de lavado, las muestras se resuspendieron en 40 µl de HBSS y se analizaron utilizando un iQue Screener Plus® con el software iQue Forecyt® (Sartorius, Alemania). Para cada muestra, se recogieron un mínimo de 100 cuentas. Las perlas conjugadas se controlaron en función de la dispersión directa y la dispersión lateral y luego se controlaron mediante fluorescencia de aloficocianina (APC). La población de perlas fluorescentes de APC se identificó y midió para determinar la intensidad fluorescente media de FITC, que representa la deposición de C3b/iC3b. El calibrante NIBSC 20/162 se trazó como una curva logística (PL) de 4 parámetros con ponderación 1/Y2 y se calculó el rango lineal. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de cada muestra se interpoló con la curva NIBSC 20/162 4PL y la concentración calculada que alcanzó el rango lineal se multiplicó por el factor de dilución para asignar la actividad de los sueros como Unidades Activadoras del Complemento (CAU).

Se acoplaron FluoSpheres™ (Thermo Fisher, F8816) modificados con carboxilato fluorescente carmesí de 1 µm con proteína de pico completa del SARS-CoV-2 (Lake Pharma, 46,328) mediante un proceso sulfo-NHS/EDC de dos pasos42. En una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos (Thermo Scientific; 612U96), 20 μL de muestras prediluidas (dilución en serie de diez puntos de 1:20 a 1:10,240) o reactivo calibrador de diagnóstico de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 (NIBSC; 20/162) se mezclaron con 20 µl de tampón DPBS-GACM (PBS de Dulbecco suplementado con glucosa al 0,1 % p/v, BSA al 0,5 % p/v, CaCl2 0,9 mM y MgSO4 0,5 mM a pH 7,4) que contenían un millón rosario. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 37 °C, con agitación a 900 rpm, antes de agregar 20 µl de plasma humano empobrecido en IgM e IgG diluido 1:1043 y 40 µl de DPBS-GACM que contenía 2,5 × 106/ml. células HL-60 diferenciadas con granulocitos (ATTC; CCL-240, diferenciadas con N, N-dimetilformamida al 0,8% durante 5 días). La placa se incubó durante 30 min a 37 °C con agitación a 900 rpm y se detuvo la fagocitosis colocando la placa en hielo y agregando 80 μL de DPBS frío con EDTA al 0,02%. Las muestras se analizaron utilizando un iQue Screener Plus® con el software iQue Forecyt® (Sartorius, Alemania). Las unidades de opsonofagocitosis (OU) se cuantificaron interpolando el MFI de las muestras de prueba de una curva estándar 4PL del calibrante NIBSC 20/162 (designado para tener 1000 unidades de actividad opsonofagocítica anti-SARS-CoV-2).

En el primer estudio, el día antes del desafío, se administraron a hámsteres 2 ml de anticuerpos purificados (10 mg/ml), anticuerpos purificados por afinidad (1 mg/ml) o fragmentos F(ab′)2 (1 mg/ml). por vía intraperitoneal.

En un segundo estudio, se administraron fragmentos F(ab′)2 (1 mg/ml) o PBS en un volumen de 1 ml por vía intraperitoneal el día anterior a la exposición y luego diariamente durante todo el estudio.

SARS-CoV-2 Victoria/01/2020, descrito anteriormente, se utilizó en el pase 3. Se realizaron diluciones de exposición en PBS estéril con administración de un total de 5,0 × 104 ufp mediante instilación intranasal (200 μl en total con 100 μl por nariz). .

Los animales fueron monitoreados dos veces al día para detectar signos clínicos anormales. A estos se les asignó una puntuación basada en los siguientes criterios: 0, normal; 1, cambios de comportamiento; 2, pelaje erizado, deshidratado, mojado/manchado alrededor del perineo; 3, arqueado, cintura de avispa, ojos cerrados; y 5, disnea (dificultad para respirar). Cada día a la misma hora se pesaron los animales.

Se tomaron hisopos faríngeos el día de la exposición y posteriormente diariamente. Se utilizó un hisopo con minipunta flocado seco (producto MW002NF; MWE, Reino Unido) para el muestreo antes de agregarlo a 1 ml de medio de transporte universal Virocult (producto MW951T; MWE, Reino Unido). Solo para el primer estudio, el día 2 posterior al desafío, se realizó un lavado nasal bajo sedación con isoflurano mediante la instilación de 200 μl de PBS en cada nariz con un tubo de alimentación flexible y recolección de extracto líquido.

Al final del estudio, los animales fueron anestesiados con isoflurano seguido de una dosis letal de pentobarbitona sódica administrada por vía intraperitoneal. Durante la necropsia se recogió una muestra de pulmón para análisis de carga viral. El pluck torácico (que consta de pulmón, tráquea y estructuras asociadas) y la cabeza se sumergieron en formalina tamponada neutra al 10% para su procesamiento histológico.

Para el primer estudio, se cuantificó el virus vivo en muestras de hisopo faríngeo y lavado nasal recolectadas el día 2 mediante un ensayo FFU. Las muestras se diluyeron en serie antes de agregarlas, por duplicado, a una monocapa de células VeroE6 en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos (sembradas 24 h antes) durante 1 h a 37 °C. Se retiraron las muestras y se agregaron medios superpuestos, luego se incubaron durante 24 h a 37 °C. Las placas se fijaron durante la noche añadiendo formalina al 20% y luego se fumigaron antes de teñir usando las mismas técnicas que para el ensayo de neutralización.

Se extrajo el ARN de muestras de hisopos faríngeos y homogeneizados de pulmón utilizando el kit veterinario único BioSprint (Indical, Reino Unido) y la plataforma Kingfisher Flex (ThermoFisher, Reino Unido). Se utilizó la reacción cuantitativa de la cadena de polimerasa con transcripción inversa del gen de la nucleocápside (N) para determinar las cargas virales y se realizó utilizando TaqPath™ 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG (Applied Biosystems™), 2019-nCoV CDC RUO Kit (Integrated DNA Technologies) y la plataforma de PCR en tiempo real QuantStudio™ 7 Flex. Las secuencias de los cebadores y la sonda N1 fueron: 2019-nCoV_N1-forward, 5' GACCCCAAAATCAGCGAAAT 3'; 2019-nCoV_N1-inverso, 5' TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG 3'; Sonda 2019-nCoV_N1, 5' FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGGACC-BHQ1 3', dirigida a una región de la nucleocápside del SARS-CoV-2. Las condiciones de ciclado fueron: 25 °C por 2 min, 50 °C por 15 min, 95 °C por 2 min, seguido de 45 ciclos de 95 °C por 3 s y 55 °C por 30 s. El estándar de cuantificación fue el ARN transcrito in vitro del ORF N del SARS-CoV-2 (número de acceso NC_045512.2) con cuantificación entre 1 × 10e1 y 1 × 10e6 copias/μl.

Las muestras de cavidad torácica y cabeza permanecieron en NBF al 10% durante un mínimo de siete días. La cavidad nasal se descalcificó utilizando una solución a base de EDTA. Luego se procesaron el lóbulo del pulmón izquierdo y la sección sagital de la cavidad nasal y se incluyeron en cera de parafina. Se cortaron secciones de 4 µm y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) y se examinaron microscópicamente. Además, las muestras se tiñeron mediante la técnica RNAscope para visualizar el ARN del virus SARS-CoV-2. Brevemente, los tejidos se trataron previamente con peróxido de hidrógeno durante 10 minutos (temperatura ambiente), recuperación del objetivo durante 15 minutos (98–101 °C) y proteasa plus durante 30 minutos (40 °C) (Advanced Cell Diagnostics). Se incubó una sonda V-nCoV2019-S (n.º de catálogo 848561, Advanced Cell Diagnostics) en los tejidos durante 2 h a 40 °C. La amplificación de la señal se realizó siguiendo el protocolo RNAscope utilizando el kit de detección RNAscope 2.5 HD—Red (Advanced Cell Diagnostics).

Todas las diapositivas se escanearon digitalmente con un escáner de diapositivas digital Hamamatsu S360 y se examinaron con el software ndp.view2 (versión 2.8.24). Las secciones fueron examinadas por un patólogo veterinario calificado que desconocía los animales y los grupos de tratamiento. Se utilizó un sistema de puntuación histopatológica semicuantitativa para evaluar las lesiones microscópicas en el pulmón y la cavidad nasal (informado en otro lugar27); Además, se utilizó el software 'Nikon NIS-Ar' (versión 5.21.02) para realizar análisis de imágenes digitales para calcular el porcentaje de área de neumonía y cuantificar la presencia de ARN viral en secciones de pulmón. Para la cavidad nasal, se aplicó un sistema de puntuación semicuantitativo para evaluar la presencia de ARN del virus: 0 = sin tinción positiva; 1 = mínimo; 2 = leve; 3 = tinción moderada y 4 = abundante.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando MiniTab, versión 16.2.2 (Minitab Inc). Se aplicó una prueba estadística no paramétrica de Mann-Whitney para determinar la significancia entre los grupos. Un nivel de significancia inferior a P = 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Los autores agradecen el apoyo del Grupo de Investigaciones Biológicas, el Grupo de Intervenciones Médicas y el Grupo de Virología y Patogénesis de UKHSA, Porton. Las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no necesariamente las de los institutos empleadores o los organismos financiadores.

Esta investigación fue financiada conjuntamente por el Instituto Nacional de Investigación en Salud (NIHR) y UK Research and Innovate (UKRI) a través de la Convocatoria de Respuesta Rápida COVID-19 para un proyecto sobre 'Desarrollo de una terapia de inmunoglobulina policlonal ovina contra COVID-19' ( Ref. MC_PC_19077).

Agencia de Seguridad Sanitaria del Reino Unido (UKHSA), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Reino Unido

Stephen Findlay-Wilson, Linda Easterbrook, Didier Ngabo, Emma Rayner, Ashley Otter, Thomas Coleman, Bethany Hicks, Rachel Halkerston, Kostis Apostolakis, Stephen Taylor, Susan Fotheringham, Amanda Horton, Irene CanoCejas, Matthew Wand, Julia A. Tree, Mark Sutton, Victoria Graham, Roger Hewson y Stuart Dowall

Internacional Therapeutic Proteins Ltd, Longford, TAS, 7301, Australia

Sandra Smith

International Therapeutic Proteins Ltd, Goleigh Farm, Selborne, GU34 3SE, Hampshire, Reino Unido

Neville Papa

MicroPharm Ltd, Station Road, Newcastle Emlyn, SA38 9BY, Reino Unido

Mateo Aldridge

Native Antigen Company, Langford Locks, Kidlington, Oxford, OX5 1LH, Reino Unido

Gareth Humphries y Holger Schuhmann

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SF-W., LE, RH y SD idearon el diseño del estudio. SF-W., LE, SS, NP, MA, GH, HS, DN, ER, AO, TC, BH, RH, KA, ST, SF, AH, IC, MW, JT, MS, VG y SD realizaron datos recopilación, análisis e interpretación. SD redactó el artículo. SF-W., SS, MA, HS, ER, MW y JT proporcionaron una revisión crítica.

Correspondencia a Stuart Dowall.

Los autores declaran los siguientes intereses financieros/relaciones personales que pueden considerarse como posibles intereses en competencia: Sandra Smith y Neville Pope son empleados de International Therapeutic Proteins Ltd. Matthew Aldridge es un empleado de MicroPharm Ltd. Gareth Humphries y Holger Schuhmann son empleados de Compañía de antígenos nativos. Todos los demás autores declaran que no conocen intereses financieros en conflicto o relaciones personales que pudieran haber influido en el trabajo presentado en este artículo.

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Findlay-Wilson, S., Easterbrook, L., Smith, S. et al. Refinamiento de una terapia con inmunoglobulinas de origen ovino contra el SARS-CoV-2, con comparación de fragmentos completos de IgG versus F(ab′)2. Informe científico 13, 13912 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40277-4

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Recibido: 25 de enero de 2023

Aceptado: 08 de agosto de 2023

Publicado: 25 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40277-4

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