Mejorando un SARS - Mascarilla Co., Ltd

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 4690 (2023) Citar este artículo

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Las pruebas de antígenos de flujo lateral se han utilizado ampliamente en la pandemia de Covid-19, lo que permite obtener resultados de pruebas de diagnóstico más rápidos y previene una mayor propagación viral mediante el aislamiento de personas infectadas. La realización de este cribado debe realizarse con pruebas que muestren una sensibilidad satisfactoria para poder detectar con éxito la proteína diana y evitar falsos negativos. El objetivo de este estudio era crear una prueba de flujo lateral que pudiera detectar la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2 en concentraciones bajas comparables a los límites de detección reclamados por las pruebas existentes en el mercado. Para ello, fueron necesarios varios ajustes durante la investigación y desarrollo de los prototipos hasta que fueran consistentes con estos criterios. Las alternativas propuestas de aumentar la concentración de anticuerpos en la línea de prueba y agregar una intermembrana entre la almohadilla de conjugado y la membrana de nitrocelulosa lograron aumentar la sensibilidad cuatro veces y generar un nuevo prototipo de prueba rápida llamado “prueba de inmunoensayo intermembrana de flujo lateral” (LFIIT). . Este prototipo mostró un límite de detección adecuado (2,0 ng mL-1) manteniendo la asequibilidad y la simplicidad en los procesos de fabricación.

En diciembre de 2019, varios pacientes fueron hospitalizados en la ciudad de Wuhan, provincia de Hubei, China, con síntomas respiratorios similares a la neumonía de etiología desconocida, y estudios posteriores mostraron evidencia convincente de que el mercado de mariscos y vida silvestre de Huanan en Wuhan podría estar relacionado con el brote. El agente causal fue identificado como un betacoronavirus del subgénero sarbecovirus, perteneciente a la subfamilia Orthocoronavirinae, y fue denominado inicialmente como 2019-nCoV, que luego pasaría a llamarse SARS-CoV-21.

Los coronavirus son virus de ARN monocatenario de sentido positivo envueltos que afectan principalmente al tracto respiratorio, pero también son capaces de provocar efectos neurológicos, entéricos y hepáticos2,3. Hasta diciembre de 2019, se sabía que seis coronavirus infectaban a los humanos, cuatro de ellos provocando síntomas leves similares a los de la gripe, mientras que los otros dos eran responsables de epidemias altamente patógenas: SARS-CoV y MERS-CoV4,5,6. Asimismo, en marzo de 2020, la Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró pandemia global la enfermedad del nuevo coronavirus (COVID-19), causada por el SARS-CoV-27,8.

El SARS-CoV-2 comparte un 79,5% de similitud genética con el SARS-CoV y el ensamblaje de partículas virales depende de cuatro proteínas estructurales principales: proteínas de membrana (M), nucleocápside (N), envoltura (E) y espiga (S), además de proteínas no estructurales y accesorias9,10. El principal método de infección del SARS-CoV-2 se basa en la glicoproteína Spike, que muestra una estructura trimérica en la superficie del virus. Está compuesto por dos subunidades: S1 y S2, siendo que S1 tiene un dominio de unión al receptor (RBD) y es responsable de unirse con la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), el principal receptor del SARS-CoV-2 en las células huésped11. Por este motivo, la proteína Spike ha sido objeto de gran atención en la investigación y el desarrollo de fármacos terapéuticos y vacunas para la COVID-1912. Sin embargo, la proteína Spike es también la proteína estructural más afectada por mutaciones genéticas en diferentes variantes del SARS-CoV-2, lo que conduce a cambios importantes en el reconocimiento de anticuerpos, afectando las pruebas de diagnóstico y las vacunas13. Estudios similares demostraron que la proteína N está mucho más conservada entre variantes y sus mutaciones no afectan la unión de anticuerpos en las pruebas de diagnóstico rápido hasta el momento, lo que la convierte en un mejor objetivo para las pruebas rápidas del antígeno del SARS-CoV-214.

Las pruebas rápidas ofrecen varias ventajas sobre los métodos de laboratorio tradicionales que requieren personal y equipos capacitados y requieren más tiempo para obtener resultados15. Además, las pruebas de antígenos tienden a correlacionarse bien con el estado de contagio del paciente, revelándose como una poderosa herramienta para aislar a los infectados y reducir la propagación viral, en comparación con los métodos moleculares16.

En este escenario, Hilab es un laboratorio clínico remoto que es capaz de realizar varias pruebas clínicas en diferentes muestras humanas con la ayuda de equipos portátiles patentados desarrollados por el equipo de investigadores multidisciplinarios de la empresa. El servicio Hilab utiliza tecnologías de Internet de las cosas (IoT) e inteligencia artificial (IA) para proporcionar resultados doblemente verificados que se recopilan de las muestras a través de los dispositivos y se analizan mediante redes de aprendizaje profundo que brindan una primera visión del estado de salud de un paciente. Luego, estos datos son verificados por profesionales de la salud que validan, firman y envían los informes a los correos electrónicos y teléfonos celulares del paciente en minutos. Hilab Flow (Fig. 1) es uno de los principales dispositivos de la empresa, un pequeño analizador portátil (12,4 × 12,4 × 12,7 cm; 0,45 kg) que opera en un escenario multimetodológico y es capaz de realizar inmunocromatografía, inmunofluorescencia, colorimetría y química seca. pruebas en el punto de atención con la tecnología de servicio de la empresa como fondo. Gasparín et al. publicó recientemente un trabajo que describe el uso de Hilab Flow para la medición de hemoglobina mediante colorimetría de química seca de flujo vertical en sangre completa como parte de una prueba de hemograma completo desarrollada por investigadores de Hilab, aunque la mayoría de las pruebas realizadas en Hilab Flow se basan en inmunoensayos de flujo lateral ( LFIA)17.

Hilab Flow, un dispositivo capaz de realizar pruebas de flujo lateral y flujo vertical en el punto de atención.

El dispositivo está patentado y registrado en la Agencia Brasileña de Vigilancia Sanitaria (ANVISA—número de registro 80583710007) y está equipado con sensores CMOS y fuentes de luz multiespectrales capaces de iluminar la cápsula que contiene la tira en el interior del dispositivo. Tras la emisión de luz y la recepción de la señal, los datos se capturan y procesan a través de un software patentado que emplea procesamiento de imágenes, aprendizaje profundo, redes neuronales y otras técnicas de inteligencia artificial para calcular las relaciones señal-ruido mediante la medición de la densidad óptica de formación de picos de las bandas. .

Los LFIA son bien reconocidos por su buen desempeño en las pruebas en el lugar de atención, eliminando la necesidad de profesionales altamente capacitados o infraestructura de laboratorio y brindando asequibilidad con su bajo costo18. Estos atributos hacen que las LFIA sean especialmente efectivas para llegar a poblaciones con bajos recursos y/o falta de estructura, así como a escenarios de pruebas de alta demanda, como emergencias sanitarias o pandemias19. Los LFIA tipo "sándwich" son dispositivos de diagnóstico en papel que funcionan con principios inmunocromatográficos para la detección de analitos clínicamente relevantes en una variedad de muestras. Después de dispensar la muestra con un tampón en funcionamiento en la almohadilla de muestra, el analito, si está presente, interactúa con reactivos secos como nanopartículas conjugadas con anticuerpos y migra por acción capilar hasta que los complejos inmunes llegan a la línea de prueba, compuesta por un segundo anticuerpo para el mismo analito, que se unirá a los reactivos y mostrará una señal reactiva. La tira reactiva también contiene una segunda línea con anticuerpos específicos para un conjugado de control, para demostrar que la tira está funcionando correctamente, actuando como control interno20.

Para garantizar un buen manejo de la propagación viral en COVID-19, las pruebas rápidas utilizadas para el cribado deben mostrar buena sensibilidad para la detección de la proteína N del SARS-CoV-2, evitando falsos negativos y proporcionando información correcta sobre el estado de infección. Teniendo esto en cuenta, el concepto de límite de detección como la concentración más baja de analito que puede diferenciarse con seguridad del blanco es una herramienta importante para la evaluación de la sensibilidad en las pruebas de diagnóstico21, y esta información puede conducir a la identificación de la necesidad de una sensibilidad estrategias de amplificación a la hora de desarrollar estas soluciones. El desempeño de la sensibilidad clínica de varias pruebas de diagnóstico del antígeno N del SARS-CoV-2 disponibles comercialmente en Brasil fue comparado en un artículo reciente publicado por Freire et al., en el que los autores describieron la variación de la sensibilidad en un rango de 9,8 a 81,1%. Las bajas sensibilidades de estas pruebas de detección podrían obstaculizar la eficacia de las pruebas masivas para controlar la propagación viral del SARS-CoV-2 al permitir que las personas infectadas permanezcan en estrecho contacto con sus homólogos sanos22.

En este trabajo describimos información comparativa sobre estrategias de aumento de la sensibilidad aplicadas en el desarrollo de una nanopartícula de oro LFIA para la detección del antígeno (proteína N) del SARS-CoV-2. En primer lugar, un aumento de la concentración de anticuerpos en la línea de prueba pudo duplicar la sensibilidad del prototipo. Para mejorar aún más la sensibilidad y alcanzar o superar límites de detección comparables a las pruebas de evaluación comparativa del mercado, era necesaria una segunda estrategia. En este sentido, se evaluaron dos rutas: aumento de la concentración de conjugado de oro coloidal e inserción de una intermembrana de algodón para aumentar el tiempo de interacción anticuerpo-antígeno.

Todos los prototipos de prueba descritos en este trabajo fueron desarrollados y probados por el equipo de investigación y desarrollo en innovación de laboratorio (inmunocromatografía) de Hilab, Brasil, y evaluados en Hilab Flow (registro ANVISA no. 80583710007), así como a simple vista para obtener la mejor correlación y aplicabilidad.

Se adquirieron nanopartículas de oro coloidal (40 nm) de Arista Biologicals y se utilizaron como etiqueta de detección para los anticuerpos de prueba y de control. Se analizó la absorbancia de los conjugados con un espectrofotómetro Nanodrop UV-Vis (Thermo Scientific). La solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizada para la dilución de los anticuerpos y la preparación de tampones se adquirió de Sigma Aldrich (CAT P7059). Los anticuerpos de captura para las líneas de prueba y control se adquirieron de Arista Biologicals (mAb de nucleoproteína COVID-19 e IgG antiratón de cabra, respectivamente). Para la laminación de las láminas LFIIT, se utilizó fibra de vidrio Estándar 14 de Cytiva (22 mm × 50 m) como almohadilla de muestra y de conjugado (355 µm de espesor a 53 kPA). Para la estrategia intermembrana, se adquirieron de Cytiva un filtro de fibra de vidrio unido Whatman MF1 y un material de fibra de algodón CF3 (322 µm de espesor a 53 kPA) (22 mm × 50 m). La membrana de nitrocelulosa CN140 se adquirió de Sartorius (25 mm × 100 m, espesor 225-255 µm, velocidad capilar de 95-155 s/40 mm). Se utilizó material de fibra de algodón CF5 (954 µm de espesor a 53 kPA) como almohadilla de mecha y se compró de Cytiva (27 mm x 50 m). Las pruebas de nivel de detección se realizaron con la proteína N recombinante FPZ0513 de Fapon SARS-CoV-2, expresada en E. coli. La comparación de la intensidad de la línea de prueba se realizó con el control de antígeno Zeptometrix SARS-CoV-2 0810590CFHI. La dispensación de líneas de prueba/control y CGC se realizó con un dispensador de reactivos de flujo lateral suministrado por JH.Bio (Modelo: XYZ3020). El secado de todos los materiales se realizó con una incubadora de horno de aire forzado adquirida en Solidsteel (modelo SSB.O.DU-342L). El corte de las láminas en tiras reactivas de flujo lateral se realizó en una cortadora de guillotina automática (Xangai Jiening Biotec, modelo CM3030). Para centrifugar el CGC hasta 30 OD se utilizó una microcentrífuga modelo NT805 adquirida en Novatécnica.

Se conjugaron pasivamente nanopartículas de oro coloidal (40 nm) con anticuerpos antinucleocápside del SARS-CoV-2 disponibles comercialmente (Arista Biologicals, Allentown, PA). La concentración original de conjugado de oro coloidal (CGC) fue de 20 OD con un pH dependiente del lote de 8,5 a 9,2. Cuando correspondía, el oro coloidal se concentró a 30 OD en una microcentrífuga (8000 xg, 8 °C durante 20 min). Para concentrar el CGC, después de la centrifugación, se descartó el volumen proporcional de sobrenadante sin resuspender el sedimento. Después del pipeteo, el sedimento se resuspendió en un baño ultrasónico y la nueva DO se confirmó con un espectrofotómetro UV-Vis Nanodrop One, a 530 nm. Se roció una mezcla de 80 % de CGC anti-N y 20 % de CGC de control (IgG de ratón) (10 µl cm-1) sobre las almohadillas de conjugado para ensamblarlas en las tiras reactivas.

El LFIIT tiene modificaciones respecto a un flujo lateral convencional, para inserción intermembrana. De esta manera, el diseño del modelo se basó en una almohadilla de muestra, una almohadilla de conjugado, una intermembrana, una membrana de nitrocelulosa y una almohadilla absorbente. Para preparar la almohadilla de muestra, se realizó un pretratamiento con una solución de tetraborato de sodio (50 mM, pH 7,5, 1 % BSA), con inmersión en la solución tampón durante aproximadamente dos horas (~ 25 °C, ~ 50 % RH) . Para secar la almohadilla de muestra, el material se colocó en una incubadora de horno de secado forzado con aire (~ 20% RH, 37 °C) durante 2 h. La almohadilla de conjugado se roció con la mezcla de CGC en una concentración de OD 20 con sacarosa (5,0%) y trehalosa (5,0%), con un dispensador de reactivos de flujo lateral. Después de la impregnación, las CGC también se secaron en una incubadora de horno de secado con aire forzado (~ 20% RH, 37 °C) durante dos horas. Los anticuerpos de captura se dispensaron como líneas de prueba y control en la membrana de nitrocelulosa utilizando el mismo dispensador de reactivos de flujo lateral. Los anticuerpos se diluyeron en una solución de PBS 0,01 M (pH 7,4) hasta la concentración deseada y las láminas impregnadas se secaron en una incubadora de horno de secado forzado con aire (~ 20 % RH, 37 °C) durante dos horas. Después de secar los componentes, la almohadilla de muestra (1,5 cm × 0,4 cm), la almohadilla de conjugado (1,0 cm × 0,4 cm), la intermembrana (0,7 cm × 0,4 cm), la nitrocelulosa (2,5 cm × 0,4 cm) y la almohadilla absorbente (1,5 cm × 0,4 cm). 0,4 cm) se laminaron secuencialmente sobre tarjetas adhesivas estándar de 0,2 mm de espesor y las hojas se cortaron en tiras de flujo lateral de 4,0 mm con un cortador de guillotina automático.

Para simular el procedimiento de prueba y obtener las respuestas analíticas correspondientes, las muestras comerciales de control/calibrador, que se describen a continuación, se diluyeron en el tampón de extracción proporcionado en un frasco cuentagotas hasta las concentraciones o proporciones descritas. Para iniciar la prueba, se dispensan cuatro gotas de la solución de extracción (~ 80 μl) directamente en la región indicada de la almohadilla de muestra. Los resultados se leyeron después de 15 minutos con una interpretación visual (a simple vista) como "reactivo" con una línea de prueba aparente y "no reactivo" para ninguna línea de prueba aparente, y un análisis Hilab Flow resultó como "positivo" o "negativo".

Para realizar los experimentos de sensibilidad y límite de detección (LOD), se utilizó una proteína de nucleocápside del SARS-CoV-2 purificada (FPZ0513, Fapon, Taiwán, CN). La proteína se diluyó en 80 μl del tampón de ejecución prototipo en concentraciones predefinidas: 10 ng mL-1, 5 ng mL-1, 3,75 ng mL-1, 2 ng mL-1 y 1 ng mL-1, correspondientes a un inóculo de proteínas de 0,8 ng, 0,4 ng, 0,28 ng, 0,16 ng y 0,08 ng por prueba, respectivamente. Las pruebas se realizaron inicialmente utilizando cinco réplicas y, para comprender mejor los puntos de corte y los límites, las réplicas se aumentaron a 20 en concentraciones umbral críticas (cerca del punto de corte). La concentración definida como límite de detección de la prueba fue considerada cuando el 95% de las réplicas (19/20) presentaron líneas de prueba reactivas, independientemente de la intensidad obtenida23. Respecto al material comercial de control de antígenos, se utilizó Zeptometrix SARS-Related Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Isolate: Hong Kong/VM20001061/2020 Culture Fluid (Heat Inactivated) (número de catálogo 0810590CFHI) y se realizaron las diluciones proporcionales aplicables en el tampón de extracción del ensayo.

Este estudio se realizó únicamente con el prototipo de prueba rápida y no se utilizaron muestras humanas para su optimización. Solo se utilizó una proteína N recombinante purificada comercial del SARS-CoV-2 y un material de control elaborado con partículas virales inactivadas del líquido de cultivo, por lo que no se aplica ninguna autorización del comité de ética ni el consentimiento del paciente.

Los datos estadísticos se analizaron y representaron utilizando el software Graphpad Prism (versión 7, San Diego, CA, EE. UU.). Se llevó a cabo una prueba ANOVA unidireccional para comparar los efectos de diferentes estrategias de mejora de la sensibilidad sobre la intensidad de las líneas de prueba capturadas mediante la medición de la densidad óptica con el dispositivo Hilab Flow. Cuando fue apropiado, se realizó una prueba de Tukey post-hoc. El nivel de significancia se fijó en p ≤ 0,05.

El prototipo original de la prueba descrita en este trabajo se desarrolló siguiendo una optimización paso a paso de los componentes individuales, con los mejores candidatos en cada experimento avanzando a la siguiente etapa de desarrollo, hasta que se definieron la tira de varilla medidora completa y el tampón de ejecución, con una concentración de conjugado de 20 OD rociada en una velocidad de dispensación de 10 μL cm-1 y una línea de prueba de 1,5 mg mL-1 de anticuerpos. Después del desarrollo de todos los componentes del kit de prueba, es necesario evaluar la sensibilidad preliminar del prototipo para verificar su compatibilidad con el uso previsto y la concentración del analito a detectar. Esta verificación generalmente resulta en necesidades de optimización adicionales para los componentes de prueba hasta que se cumplan los requisitos24. Las estrategias implementadas por el grupo para abordar este problema de sensibilidad analítica se describen a continuación.

El primer prototipo fue desafiado con una prueba LoD recomendada en el modelo de la FDA para el desarrollo de pruebas de antígeno SARS-CoV-2, que establece el LoD como la concentración más baja de proteína detectada por 19 de las 20 réplicas de la prueba en el experimento23. La detección del LoD inicial en este prototipo no optimizado dio como resultado 7,5 ng mL-1 de proteína N, lo cual fue corto en términos de sensibilidad en comparación con los datos de la literatura y pruebas rápidas similares del mercado25,26.

Después de estos experimentos, se implementó un ajuste en la concentración de anticuerpos de la línea de prueba, duplicándose la cantidad a 3,0 mg mL-1, que era una tasa de impregnación aceptable en términos de costo (el aumento aún estaba dentro del precio objetivo para el producto futuro, en comparación con los locales). competidores) y unión efectiva de anticuerpos a la nitrocelulosa sin desplazamiento durante la manipulación de la tira y la ejecución de la prueba, ya que concentraciones más altas tienden a afectar negativamente la fuerza de las interacciones entre la proteína y la nitrocelulosa y posiblemente podrían conducir a falsos positivos27. La detección inicial del LoD se realizó con el protocolo de quintuplicado de pruebas para cuatro concentraciones iniciales de proteína N: 100,0, 10,0, 5,0 y 1,0 ng mL-1, con interpretación visual y del equipo de los resultados, como se muestra en la Tabla 1.

Los resultados mostraron que el LoD del prototipo estaba entre concentraciones de 5,0 y 1,0 ng mL-1 de proteína N. Dado que la concentración del anticuerpo de la línea de prueba se duplicó, se planteó la hipótesis de que un límite de detección intermedio sería la mitad del límite inicialmente establecido (7,5 ng mL-1).

Por lo tanto, para verificar el verdadero límite de detección entre 5,0 y 1,0 ng mL-1, se realizó un experimento con 20 réplicas utilizando una concentración de proteína N de 3,75 ng mL-1. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 2, y en la Fig. 2 se muestra una imagen representativa de las tiras utilizadas para realizar estos estudios.

P1 + 3,0 Límite de resultados de detección para 3,75 ng mL-1 de proteína N del SARS-CoV-2. Réplicas 1, 12 y 19: las flechas indican líneas tenues como señales reactivas. Réplica 8: sin línea de prueba aparente (no reactiva). La línea de control muestra el correcto funcionamiento de las tiras reactivas.

Por lo tanto, la estrategia de aumentar la concentración de anticuerpos de captura resultó en un aumento proporcional de la sensibilidad, estableciendo una buena competitividad del prototipo entre otras pruebas disponibles comercialmente con el LoD de 3,75 ng mL-122,25,26. Este prototipo pasó a la siguiente etapa de desarrollo y optimización.

Tras lograr la primera mejora de la sensibilidad para igualar las pruebas de la competencia en el mercado, todavía era posible y viable una segunda optimización de la sensibilidad para garantizar un diagnóstico fiable de las infecciones tempranas y de baja carga viral. Aumentar la DO del conjugado podría solucionar este problema aumentando la cantidad de anticuerpo marcado con oro por tira. Sin embargo, esta estrategia implica un aumento importante en los costos de los reactivos, considerando que el CGC es uno de los componentes más costosos en una prueba de flujo lateral28. La investigación sobre la literatura actual reveló estrategias asequibles y efectivas para aumentar la sensibilidad en los LFIA al permitir un tiempo de reacción más prolongado entre el analito y el CGC con la inserción de materiales humectables/porosos entre la almohadilla de conjugado y la membrana de nitrocelulosa, como esponjas29, poliéster, celulosa y fibras de vidrio30, mientras que otros aplican un concepto similar utilizando una barrera de cera para aumentar el tiempo de interacción antígeno-anticuerpo31. La inserción de una capa extra de material es capaz de retener o ralentizar el flujo de líquido a través de la tira, emulando un paso de incubación sobre la marcha mientras los anticuerpos y antígenos permanecen en estrecho contacto durante más tiempo. Estas modificaciones geométricas y de la arquitectura del papel permiten la manipulación de los atributos de LFIA y tienen un impacto importante en la sensibilidad de la prueba y el rendimiento general32.

Con esto en mente, se generaron nuevos prototipos de tiras como se describe en la sección de materiales y métodos, ya sea concentrando el CGC a 30 OD o reorganizando el diseño de los LFIA para incluir una intermembrana (7 mm de longitud) entre la almohadilla de conjugado y la nitrocelulosa. (Fig. 3B), a diferencia de una disposición tradicional de tira de flujo lateral (Fig. 3A).

LFIA tradicional y un nuevo diseño propuesto llamado LFIIT. (A) Vista lateral de una tira de flujo lateral tradicional, que muestra los componentes de prueba y el orden de montaje. (B) Vista lateral de un prototipo LFIIT (inserción de una intermembrana), que muestra los componentes de prueba y el orden de montaje. Imágenes no en escala y proporción.

Para evaluar el efecto de diferentes materiales en la composición intermembrana, se probaron una fibra de vidrio (MF1, Whatman) y una fibra de algodón (CF3, Whatman). Los nuevos prototipos, denominados P2 (original P1 + 3.0), P2 + 30 OD (original con 30 OD CGC), P2 + MF1 (original con intermembrana MF1) y P2 + CF3 (original con intermembrana CF3), se probaron por primera vez utilizando un control de antígeno disponible comercialmente basado en un fluido de cultivo inactivado de SARS-CoV-2 (Zeptometrix, NY, EUA), con diluciones seriadas para medir el rendimiento inicial de los prototipos. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Los resultados con el control de antígeno revelaron que los prototipos P2 + 30 OD y P2 + CF3 tuvieron una mejora de sensibilidad similar en comparación con el prototipo P2. Se pueden observar imágenes representativas del experimento en la Fig. 4A. La comparación de las intensidades relativas de las líneas de prueba capturadas por Hilab Flow por la densidad óptica de las líneas (Tabla complementaria S1) reveló que tanto las señales P2 + 30 OD como P2 + CF3 fueron significativamente más altas que los otros prototipos, y tampoco significativamente diferentes de entre sí (Fig. 4B,C). Este resultado revela que la inserción de la intermembrana de algodón fue capaz de aumentar potencialmente la señal en la misma magnitud de concentración del CGC a 30 OD, lo que significa que el mayor tiempo de reacción entre los anticuerpos y el antígeno proporcionado por el material podría resultar en la misma sensibilidad analítica. o LoD de un aumento de CGC del 50% con una solución más simple y razonable.

Los prototipos de LFIA señalan una comparación para un control de antígeno del SARS-CoV-2 disponible comercialmente. (A) Imagen representativa de las pruebas. P2: P1 original + 3,0 (concentración de anticuerpos de 3,0 mg mL-1 en la línea de prueba); P2 + 30 OD: original con 30 OD CGC; P2 + MF1: original con intermembrana MF1; P2 + CF3: original con intermembrana CF3; La línea de control muestra el funcionamiento adecuado de las tiras reactivas. (B) Gráfico de barras que muestra la comparación estadística entre intensidades de las líneas de prueba en diferentes prototipos utilizando un control de antígeno SARS-CoV-2 disponible comercialmente. (C) Comparación de señales para una dilución 1:16 del mismo material de control. Señal: Unidades de intensidad relativa medidas por Hilab Flow. # representa una diferencia significativa en comparación con el grupo P2. *Representa una diferencia significativa respecto al grupo P2+MF1. La comparación entre P2 + 30OD y P2 + CF3 no mostró diferencias estadísticas significativas. Se realizaron ANOVA unidireccional y prueba post hoc de Tukey cuando fue apropiado para p <0,05.

A pesar de los prometedores resultados mostrados anteriormente utilizando el control comercial, aún era necesario un experimento con la proteína N del SARS-CoV-2 para confirmar la mejora en el LoD de los prototipos, además de la comparación entre los candidatos para una mejor toma de decisiones sobre el desarrollo de el ensayo.

Para verificar la mayor sensibilidad de las nuevas combinaciones, se probaron los prototipos P2 + 30 OD y P2 + CF3, ya que presentaban el mejor potencial en el experimento anterior. La proteína N del SARS-CoV-2 se diluyó a una concentración de 2,0 ng ml-1, generando una cantidad bruta de 0,16 ng de proteína por prueba después del cálculo de la dilución en tampón de ejecución/extracción, lo que representa la mitad de la concentración establecida para el último LoD. experimento. Los resultados de esta detección de LoD se muestran en la Tabla 4 y la comparación visual se puede observar en la Fig. 5.

Comparación del prototipo P2 + CF3 y P2 + 30 OD en el límite de detección utilizando una dilución de proteína de 2,0 ng mL-1. P2 + CF3: prototipo original con adición de intermembrana CF3. P2 + 30 OD: original con 30 OD CGC. Las líneas débiles como señales reactivas están indicadas por las flechas. La línea de control muestra el correcto funcionamiento de las tiras reactivas.

Como se observa en la Fig. 5, la intensidad de la señal en la línea de prueba fue relativamente baja para una concentración de proteína N de 2,0 ng ml-1, lo que indica que el LoD de los prototipos estaba cerca de esta concentración. Dado que este experimento mostró resultados similares para ambos prototipos, se seleccionó el candidato más asequible entre ellos para la prueba LoD completa (P2 + CF3 o LFIIT), aumentando el número de réplicas a veinte.

Para este experimento se siguió el protocolo de prueba recomendado del límite de detección estándar, como de costumbre. La proteína N se diluyó en la misma concentración probada en la comparación LOD P2 + 30 OD y P2 + CF3 (2,0 ng mL-1). El límite de detección esperado debía definirse para al menos 19 resultados reactivos en 20 réplicas analizadas (tasa de detección del 95%). Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Los resultados mostraron que el LFIIT proporcionó una señal reactiva en 19 de las 20 réplicas analizadas, definiendo el límite de detección de la prueba como 2,0 ng mL-1 de proteína N, o 0,16 ng de inóculo total de proteína por prueba, confirmando así el aumento de la sensibilidad. mediante el uso de la intermembrana y descartando la necesidad de aumentar el oro coloidal. Una imagen representativa de los resultados se puede observar en la Fig. 6.

Límite final de resultados de detección para el prototipo LFIIT con 2,0 ng mL-1 de proteína N del SARS-CoV-2. Prueba de inmunoensayo intermembrana de flujo lateral LFIIT (P2 + CF3). Las líneas tenues como señales reactivas están indicadas por las flechas. La línea de control muestra el funcionamiento adecuado de las tiras reactivas.

Las pruebas de antígenos del SARS-CoV-2 representan una herramienta importante para el manejo y control de la pandemia, ya que se utilizan ampliamente para la detección masiva y brindan varios beneficios sobre las metodologías centradas en el laboratorio, especialmente cuando el tiempo de respuesta es crítico y se necesitan resultados inmediatos, a pesar de ser menos sensibles que las pruebas moleculares. pruebas en general33. Esto conduce a un cambio en el equilibrio costo-efectividad a favor del uso de LFIA en Covid-19, con estimaciones que sugieren reducciones significativas en el número de casos, hospitalizaciones, ingresos en UCI y muertes34. Sin embargo, para cumplir esta función, las pruebas deben mostrar una sensibilidad adecuada y un bajo coste. Estos parámetros permiten estrategias de detección masiva de antígenos que pueden implementarse incluso en individuos asintomáticos, lo que representa pruebas de vigilancia para la prevención y el control de brotes recurrentes35.

En nuestro trabajo, sorprendentemente, la estrategia económica y algo simple de la adición intermembrana produjo resultados similares al aumento de la concentración del conjugado, proporcionando una segunda ganancia de sensibilidad al doble de la prueba. En total, se obtuvo un aumento de sensibilidad cuatro veces mayor para el prototipo de la prueba de inmunoensayo intermembrana de flujo lateral (LFIIT), manteniendo la asequibilidad y las condiciones de fabricación simples, lo que lo convierte en una solución competitiva y viable para las pruebas de antígeno del SARS-CoV-2.

El análisis preliminar de costos de las estrategias reveló que la concentración de conjugado implicaría un costo individual de alrededor de US$ 7,20 por hoja sin cortar, mientras que la utilización de CF3 como intermembrana en la misma cantidad de pruebas costaría US$ 4,61, una reducción de costo del 35% para el mismo aumento de sensibilidad y rendimiento de la prueba. Además, la inserción de intermembranas es un proceso mucho más sencillo en cuanto a fabricación, lo que implica una reducción paralela de costes de personal, equipos e infraestructura, ya que la concentración de CGC es un proceso crítico y que requiere mucho tiempo.

También se probó un tercer prototipo que potencialmente podría aumentar aún más la sensibilidad (P2 + CF3 + 30OD), pero el límite de detección fue el mismo que el del prototipo LFIIT (datos no mostrados), posiblemente debido a la saturación de anticuerpos de la línea de prueba.

A pesar de ser fáciles de usar, escalables y económicos, los LFIA tienden a tener una sensibilidad menor que los inmunoensayos tradicionales como ELISA, debido a la naturaleza dinámica de las reacciones y la cinética de las interacciones antígeno-anticuerpo. La necesidad de facilitar las pruebas al público en general lleva a que las LFIA tengan normalmente procedimientos con pocos y simples pasos operativos, sin pasos de incubación o lavado, y esto podría conducir potencialmente a limitaciones en las interacciones antígeno-anticuerpo36.

El establecimiento del límite de detección más bajo posible también es extremadamente importante a la hora de desarrollar una prueba de antígeno del SARS-CoV-2, ya que el aislamiento de los pacientes depende en gran medida de la positividad de la prueba de antígeno, cuando la transmisibilidad es mucho más probable. Las pruebas de antígenos con límites de detección optimizados también suelen ser más fiables a la hora de garantizar que la carga viral esté por debajo de un umbral de infectividad a la hora de tomar la decisión de finalizar el periodo de aislamiento37. A continuación, en la Tabla 6, se muestra un análisis comparativo entre el LFIIT desarrollado en este trabajo y otras pruebas de antígenos del SARS-CoV-2.

Con estos resultados, es posible obtener información sobre estrategias de mejora de la sensibilidad conscientes de los costos que pueden compensar el límite de los desafíos de detección encontrados al desarrollar soluciones de diagnóstico LFIA en el punto de atención. El aumento de la concentración de anticuerpos en la línea de prueba pudo aumentar inicialmente la sensibilidad a un nivel aceptable, con la inserción de la intermembrana como una mejora complementaria al rendimiento de la prueba.

En este trabajo describimos estrategias que son viables de implementar para mejorar la sensibilidad y el límite de detección de LFIA, teniendo en cuenta los costos involucrados en el proceso. El LoD de 2,0 ng mL-1 establecido para el prototipo de prueba en este trabajo es comparable e incluso superior a la mayoría de las pruebas rápidas para la detección del antígeno SARS-CoV-2 que se encuentran en el mercado, lo que la convierte en una solución eficiente y asequible para la detección viral de COVID-19. difundir la contención y la toma de decisiones en aislamiento de los pacientes. El aumento de la sensibilidad inicial a un valor aceptable se logró con un aumento en la concentración de anticuerpos de captura en la línea de prueba. Posteriormente, la inserción de un trozo de material de fibra de algodón como intermembrana para reducir la velocidad de flujo y aumentar el tiempo de contacto antígeno-anticuerpo en el prototipo duplicó la sensibilidad de la prueba, produciendo el mismo resultado que un aumento del 50 % en la concentración de CGC con una velocidad mucho mayor. enfoque asequible. La mejora total de la sensibilidad de la prueba fue aproximadamente cuatro veces mayor en comparación con el primer prototipo, comenzando con 7,5 ng mL-1 (0,6 ng de proteína N por prueba) a 2,0 ng mL-1 (0,16 ng de proteína N por prueba), con nada menos que Reducción estimada de costos en reactivos para el prototipo final de más del 35%.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Zhu, N., Zhang, D., Wang, W., Yang, B., Song, J., Zhao, X., Huang, B., Shi, W., Lu, R., Niu, P., Zhan, F., Ma, X., Wang, D., Xu, W., Wu, G., Gao, GF y Tank, W. Un nuevo coronavirus de pacientes con neumonía en China, 2019. N. Engl. J. Med. 382, 727–733 (2020).

Weiss, S. y Leibowitz, J. Capítulo 4: Patogénesis del coronavirus. Advances in Virus Research, Volumen 81, Editor 1, Karl Maramorosch., Editor 2, Aaron J. Shatkin., Editor: Academic Press, EUA, Volumen 81, 85–164 (2011).

Holmes, KV Coronavirus (Coronaviridae). Enciclopédico. Virol. 1, 291–298 (1999).

Artículo de Google Scholar

Zaki, A., Van Boheemen, S., Bestebroer, TM, Osterhaus, AD y Fouchier, RA Aislamiento de un nuevo coronavirus de un hombre con neumonía en Arabia Saudita. N. inglés. J. Med. 367, 1814–1820 (2012).

Drosten, C. y col. Identificación de un nuevo coronavirus en pacientes con síndrome respiratorio agudo severo. N. inglés. J. Med. 348, 1967-1976 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ksiazek, TG y cols. Un nuevo coronavirus asociado con el síndrome respiratorio agudo severo. N. inglés. J. Med. 348, 1953-1966 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sharma, S., Kumar, V., Chawla, A. y Logani, A. Detección rápida del SARS-CoV-2 en la saliva: ¿Puede un endodoncista tomar la iniciativa en las pruebas de COVID-19 en el lugar de atención? En t. Endodo. J. 53(7), 1017–1019 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cucinotta, D. & Vanelli, M. La OMS declara al COVID-19 una pandemia. Acta Biomed. 91(1), 157–160 (2020).

PubMed PubMed Central Google Académico

Lima, LN, Sousa, MS & Lima, KV Los descubrimientos genómicos del SARS-CoV-2 y sus implicaciones para la pandemia de COVID-19. J. Salud Biol Sci. 8(1), 1–9 (2020).

Google Académico

Lamers, MM y Haagmans, BL Patogénesis del SARS-CoV-2. Nat. Rev. Microbiol. 20, 270–284 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Jackson, CB, Farzan, M., Chen, B. y Choe, H. Mecanismos de entrada del SARS-CoV-2 a las células. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 23, 3-20 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, P. y col. Un brote de neumonía asociado a un nuevo coronavirus de probable origen en murciélagos. Naturaleza 579, 270–273 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uğurel, O., Ata, O. y Torgut-Balik, D. Un análisis actualizado de las variaciones en el genoma del SARS-CoV-2. Turco. J. Biol. 44(7), artículo 4 (2020).

Frank, F. y col. La exploración mutacional profunda identifica las mutaciones de escape de la nucleocápside del SARS-CoV-2 de las pruebas rápidas de antígenos disponibles actualmente. Celda 185, 3603–3616 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoon, SH et al. Pruebas en el lugar de atención para la detección del SARS-CoV-2: una revisión sistemática y un metanálisis. EUR. Rev. Med. Farmacéutico. Ciencia. 25, 503–517 (2021).

CAS PubMed Google Académico

Lopera, TJ, Alzate-Ángel, JC, Díaz, FJ, Rugeles, MT & Aguilar-Jiménez, W. La utilidad de las pruebas de antígenos para predecir la contagiosidad en COVID-19. Microbio. Espectro. 10, e1962–e2021 (2022).

Artículo de Google Scholar

Gasparin, AT, Araujo, CI, Schmitt, P, Cardoso, MR, Perussolo, MC, Jesús, TC, James, E, Reis, I, Sousa, RG, Teng, F, Severo, E, Ribeiro, VH, Cardoso, M. , Silva , F. , Perazzoli , C. , Farias , JS , Almeida , B. , Junior , SR , & FIgueredo , MV Sistema Hilab , un nuevo analizador de hematología en el punto de atención respaldado por Internet de las cosas y dispositivos artificiales inteligencia. Ciencia. Reps. 12, 1-11 (2022).

Ching, KH Inmunoensayo de flujo lateral. Métodos Mol. Biol. 1318, 127-137 (2015).

Artículo PubMed Google Scholar

Di Nardo, F., Chiarello, M., Cavalera, S., Baggiani, C. & Anfossi, LT Años de aplicaciones de la técnica de inmunoensayo de flujo lateral: tendencias, desafíos y perspectivas de futuro. Sensores 21, 5185 (2021).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calabria, D. y col. Avances recientes en inmunoensayos de flujo lateral basados en enzimas. Sensores 21, 3358 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Armbruster, DA y Pry, T. Límite de blanco, límite de detección y límite de cuantificación. Clínico. Bioquímica. Rev. 29 (Suplemento 1), 49–52 (2008).

Freire, ML et al. Diferencias de rendimiento entre las pruebas rápidas de antígenos disponibles comercialmente para COVID-19 en Brasil. MÁS UNO 17(6), e0269997 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

FDA.gov. Disponible en línea: fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/policy-coronavirus-disease-2019-tests-during-public-health-emergence-revised (consultado el 11/10/2021).

Hsieh, HV, Dantzler, JL y Weigl, BH Herramientas analíticas para mejorar los procedimientos de optimización para ensayos de flujo lateral. Diagnóstico 7, 29 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jungnick, S., Hobmaier, B., Mautner, L., Hoyos, M., Haase, M., Baiker, A., Lahne, H., Eberle, U., Wimmer, C., Hepner, S., Sprenger, A., Berger, C., Dangel, A., Ippisch, S., Hahner, S., Wildner, M., Liebl, B., Ackermann, N., Sing, A. y Fingerle, V. Rendimiento de la prueba rápida de antígenos in vitro con las variantes preocupantes del SARS-CoV-2 B.1.1.7 (Alfa), B.1.351 (Beta), P.1 (Gamma) y B.1.617.2 (Delta). Microorganismos 9, 1967 (2021).

Corman, VM y cols. Comparación de siete pruebas comerciales rápidas de antígenos en el lugar de atención del SARS-CoV-2: un estudio de evaluación de laboratorio de un solo centro. Microbio de lanceta. 2(7), e311–e319 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gong, Y. et al. LFIA mejorados para la detección altamente sensible de BNP en el punto de atención. En t. J. Nanomed. 12, 4455–4466 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Yetisen, AK, Akram, MS y Lowe, CR Dispositivos de diagnóstico de microfluidos en papel para el punto de atención. Laboratorio. Chip. 13(12), 2210–2251 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tang, R. y col. Sensibilidad analítica mejorada del ensayo de flujo lateral utilizando una esponja para la detección del ácido nucleico del VHB. Ciencia. Rep. 7, 1360 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsai, TT y cols. Desarrollo de un diseño de almohadilla apilable para mejorar la sensibilidad del inmunoensayo de flujo lateral. Ciencia. Rep. 8, 17319 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sena-Torralba, A. et al. Ensayo de flujo lateral modificado con barreras de cera de retardo de tiempo como estrategia de mejora de la sensibilidad y la señal. Biosens. Bioelectrón. 168, 112559 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Parolo, C., Medina-Sanchez, M., Escosura-Muñiz, A. & Merkoçi, A. Las modificaciones simples de la arquitectura del papel conducen a una mayor sensibilidad en los inmunoensayos de flujo lateral basados en nanopartículas. R. Soc. Química. 13, 368–390 (2013).

Google Académico

Hsieh, WY y cols. Desarrollo y eficacia de dispositivos de prueba de flujo lateral en el lugar de atención para el diagnóstico rápido y masivo de COVID-19 mediante la detecciones del antígeno del SARS-CoV-2 y de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2. Diagnóstico (Basilea). 11, 1760 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Drakesmith, M., Collins, B., Jones, A., Nnoaham, K. y Thomas, DR Rentabilidad de un piloto de pruebas en toda el área de infecciones asintomáticas por SARS-CoV-2 con dispositivos de flujo lateral: un modelo y un modelo económico estudio de análisis. Servicio de salud BMC. Res. 22, 1190 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Du, Z. y col. Rentabilidad comparativa de las estrategias de prueba del SARS-CoV-2 en los EE. UU.: un estudio de modelado. Salud pública de Lancet. 6, e184-e191 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Serrano, MM et al. Comparación de inmunoensayos comerciales de flujo lateral y ELISA para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2. J.Clin. Virol. 129, 104529 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jeong, YD y cols. Diseño de pautas de aislamiento de pacientes COVID-19 con pruebas rápidas de antígenos. Nat. Comunitario. 13, 4910 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Los autores desean agradecer a Hi Technologies por el apoyo, a Aléxia Thamara Gasparin por el apoyo con el análisis estadístico, a Pâmela Fogaça Silva y Carolina Rodrigues de Araujo Perazzoli por la edición de las imágenes.

Departamento de Investigación y Desarrollo, Hilab, Campus Hilab, Jose A. Possebom, 800, Curitiba, Paraná, 81270-185, Brasil

Diego Rinaldi Pavesi Nicollete, Rafael Benedetti, Beatriz Arruda Valença, Keyla Kaori Kuniyoshi, Thainá Caroline Schuartz de Jesus, Ava Gevaerd, Erika Bergamo Santiago, Bernardo Montesanti Machado de Almeida, Sérgio Renato Rogal Júnior & Marcus Vinícius Mazega Figueredo

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DN, RB y BV conceptualizaron este trabajo y realizaron los experimentos. DN y RB realizaron análisis de datos y escribieron el borrador original. SJ y MF proporcionaron recursos y supervisión para el proyecto. Todos los autores contribuyeron al manuscrito en la revisión y edición.

Correspondencia a Diego Rinaldi Pavesi Nicollete.

Los autores declaran los siguientes intereses financieros/relaciones personales que pueden considerarse como posibles intereses en competencia. Marcus Vinícius Mazega Figueredo es el director ejecutivo de Hilab. Sérgio Renato Rogal Júnior es el CTO de Hilab. Bernardo Montesanti Machado de Almeida es el CMO de Hilab. Diego Rinaldi Pavesi Nicollete es gerente de I+D en innovación de laboratorios de Hilab y no declara intereses competitivos. Rafael Benedetti es investigador en salud del Hilab y no declara ningún interés en competencia. Keyla Kaori Kuniyoshi es investigadora de salud en Hilab y no declara ningún interés en competencia. Thainá Caroline Schuartz de Jesus es investigadora de salud en Hilab y no declara ningún interés en competencia. Ava Gevaerd es investigadora a cargo del desarrollo de métodos de electroquímica en Hilab y no declara ningún interés en competencia. Beatriz Arruda Valença es ex investigadora de salud del Hilab y no declara ningún interés en competencia. Erika Bergamo Santiago es exgerente de innovación de laboratorio de I+D en Hilab y no declara ningún interés competitivo.

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Nicollete, DRP, Benedetti, R., Valença, BA et al. Mejora de la sensibilidad de la prueba del antígeno de la nucleocápside del SARS-CoV-2 con una estrategia rentable mediante la inserción de una intermembrana de algodón. Informe científico 13, 4690 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31641-5

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Recibido: 06 de diciembre de 2022

Aceptado: 15 de marzo de 2023

Publicado: 22 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31641-5

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